ÖZET Yüksek Lisans Tezi Vitreoscilla HEMOGLOBİN GENİ KLONLANMIŞ BAKTERİLERDE L-ASPARAJİNAZ ENZİMİNİN SENTEZİ: ÖNEMLİ BİR KANSER KEMOTERAPİ AJANI Salih GENCER İnönü Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı 58 + x sayfa 2004 Danışman: Yrd. Doç. Dr. Hikmet GEÇKİL Bazı gram-negatif bakterilerde bulunan L-asparajinaz enzimi başta çocuk lösemisi olmak üzere, lenfosarkoma, melanosarkoma olmak üzere çeşitli kanserlerdeki yüksek terapötik değeri ile bilinmektedir. Onkolitik bir enzim olan L-asparajinazın bu bakteriler tarafından sentezi karbon, azot ve oksijen gibi çevresel ve besinsel faktörler tarafından oldukça regüle olmaktadır. İlk kez bu çalışma kapsamında etkin bir oksijen alım sistemi ile donatılmış rekombinant bakterilerde ve onların konakçı suşlannda {Enterobacter aerogenesve Pseudomonas aeruginosa) bu enzimin sentezinin nasıl regüle olduğu çalışılmıştır. Her iki bakteri de bu enzimi üretme potansiyelleri ile bilinen fakat oldukça farklı metabolik stratejileri olan organizmalardır. Bu çalışma, ikisi de gram-negatif bakteri olmalarına rağmen, her iki bakterinin aynı şartlar altında oldukça farklı enzim seviyelerine sahip olduğunu ve etkin bir oksijen alımı sağlayan Vitreoscilla hemoglobininin (VHb) bu bakterilerde eksprasyonu da L-asparajinaz üretiminde farklı etki yarattığım göstermiştir. Özellikle, E. aerogenes'de L-asparajinaz sentezinin VHb'nin varlığında kontrol hücrelere göre önemli ölçüde değiştiği gözlenmiştir. Bu bakteride VHb enzim üretimini 10 ila 100 kat arasında baskılarken, tersine, P. aeruginosa' dz. enzim üretiminin VHb içeren susta daha yüksek olduğu saptanmıştır. Bu nedenle, her iki bakteride enzimin katabolit represyon ve oksijenle farklı regüle olduğu ortaya konmuş ve bir bakteri için geçerli optimal üretim koşullarının diğer bir bakteri türü için kullanılamayacağı saptanmıştır. Ayrıca, çeşitli oksijen konsantrasyonlarının ve karbon kaynaklarının L-asparajinaz üretiminde sınırlayıcı rol oynadığı göz önüne alındığında etkili bir oksijen alım sistemi olan Vitreoscilla hemoglobin teknolojisinin bu enzimin üretiminde en azından bazı bakterilerde önemli bir avantaj sağlayacağı düşünülmektedir. ANAHTAR KELİMELER: L-asparajinaz; Vitreoscilla hemoglobini; Bakteriyel hemoglobin; Kemo terapötik enzimler; Anti-neop lastik ajanlar; Akut lenfoblastik lösemi
ABSTRACT Master Thesis THE SYNTHESIS OF L-ASPARAGINASE IN BACTERIA CARRYING VITREOSCILLA HEMOGLOBIN GENE: AN ENZYME USED IN CANCER THERAPY Salih GENCER Department of Biology Institute of Natural Sciences Inonu University 58 + x pp 2004 Advisior: Hikmet GEÇKİL, Assistant Professor The L-asparaginase enzyme produced by some Gram-negative bacteria is known for its high therapeutic value in certain cancers, mainly in acute lymphoblastic leukemia, lymphosarcomas and melanosarcomas. The synthesis of this enzyme by these bacteria is highly regulated by chemical and environmental factors such as carbon, nitrogen and oxygen. This study is the first, regarding the regulation of L-asparaginase synthesis in recombinant bacteria bearing a highly efficient oxygen uptake system and in their native hosts, Enterobacter aerogenes and Pseudomonas aeruginosa. Both bacteria are known for their potentials in L-asparaginase synthesis while they carry out completely different metabolic activities. This study showed that although being Gram-negative, both bacteria shows substantially different levels of enzyme activity under similar conditions and the expression of a highly efficient oxygen uptake system, the Vitreoscilla hemoglobin (VHb), causes different degree of differences in production of L-asparaginase. The presence of VHb especially in E. aerogenes caused a substantial difference in enzyme synthesis compared to control cells. VHb in this bacterium repressed the enzyme production by 10 to 100-fold, while in P. aeruginosa, contrary to this, the enzyme level of VHb expressing strain was higher than the control cells. This showed that, the optimal conditions required for enzyme synthesis by a bacterial species may not be applicable to another one. Furthermore, in applications where various carbon sources and oxygen are the limiting factors, the use of VHb (in at least certain bacteria) might be advantageous for he production of L-asparaginase. KEY WORDS: L-asparaginase; Vitreoscilla hemoglobin; Bacterial hemoglobin; Chemotherapeutic enzymes; Anti-neoplastic agents; Acute lymphoblastic leukemia 111