ÖZET Yüksek Lisans Tezi RASTGELE MUTASYONLA YÜKSEK L-ASPARAJÎNAZ AKTİVİTESİNE SAHİP ENTEROBACTER AEROGENES SUŞLARININ ELDESİ Miraç UÇKUN İnönü Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı 55 + ix sayfa 2006 Danışman: Doç. Dr. Hikmet GEÇKÎL DNA mutasyonları organizma veya hücrede kanserleşme ve çeşitli metabolik bozukluklar gibi bozuk fonksiyonlarla kendini gösterebildiği gibi, mutasyonlar aynı zamanda bu organizma veya hücrelerin değişen ortamlara uyum sağlayarak nesillerinin devam ettirilmesinde en önemli rolü oynayabilirler. Mutasyonlar, bir organizmanın genomunu oluşturan nükleotid dizisinde kendiliğinden veya çeşitli kimyasal ve fiziksel ajanlarla indüklenerek meydana gelen kalıtlanabilir değişikliklerdir. DNA sentezi (replikasyonu) kusursuz bir olay değildir. Esherichia colfde kendiliğinden mutasyon oranı zincire giren her 1 milyon nükleotitten yaklaşık birine tekabül eder. Bu tür bir değişiklik (mutasyon) tamamen rasgele olup genomun herhangi bir yerinde olabilir. Ancak, bu çeşit bir rastgele mutasyon oram çeşitli kimyasal veya fiziksel ajanlarla önemli ölçüde arttırılabilir. Bu çalışmada, kimyasal bir mutajenik ajan olan etilmetan sülfonat (EMS) kullanılarak gram-negatif bir bakteri olan Enterobacter aerogenes'in L-asparajinaz enzimini yüksek düzeyde üreten mutantları seçilmiştir. İnsanlarda bulunmayan bu enzim kanser kemoterapisinde yaygın kullanımı ile bilinmekte olup, E. aerogenes ve diğer birkaç gram-negatif bakteri kullanılarak üretilmektedir. Bu çalışmada, mutant eldesi için optimal EMS konsantrasyonu belirlenerek, mutantların seçilimi ve enzim düzeyindeki değişimler yabanıl tip bakteri ile kıyaslanmıştır. EMS ile mutasyona tabi tutulmuş bakteri hücrelerinden L-asparajinaz mutantlarının seçilimi için indikatör ortam kullanılmış ve yaklaşık 100,000 koloni arasından 3 adet koloninin L- asparajinaz düzeyinde belirgin bir artış görülmüştür. Bu 3 koloni izole edilerek araştırmanın ileri safhalarında kullanılmışlardır. Genel olarak, bu 3 mutantın, değişik oranlarda olmakla beraber (% 30-65) yabanıl tipe göre daha yüksek düzeyde L-asparajinaz enzimi akti vitesine sahip olduğu belirlenmiştir. Mutantlar arasında ise en yüksek enzim seviyesi E. aerogenes ansmu-2 mutantı için belirlenmiştir. Bununla birlikte, EMS mutagenez'i ile elde edilmesi bütün mutantların yüksek L-asparajinaz seviyesi yoktur. Ancak, EMS ile elde edilen mutantların çoğunda L-asparajinaz seviyesi orijinal yabanıl tipten daha düşük olduğundan bu tür mutantlar çalışmanın ileri safhalarına dahil edilmemişlerdir. ANAHTAR KELİMELER: Raslantısal Mutagenez; Etilmetan sülfonat (EMS); L-asparajinaz; kemoterapötik enzimler ıı
ABSTRACT Master Thesis TO GET ENTEROBACTER AEROGENES STRAINS HAVING HIGH L-ASPARAGINASE ACTIVITIES VIA RANDOM MUTATION Miraç UÇKUN Department of Biology Institute of Natural Sciences Inonu University 55+ ix pp 2006 Supervisor: Hikmet GEÇKİL, Associate Professor While DNA mutations are the causes of malfunctions as cancer and various metabolic diseases in an organism or cell, mutations also can play important role in adaptation of organisms or cells to changing conditions for the continuing existence. Mutations are the inheritable changes occurring in nucleotide sequence of genome of an organism and they can be arisen spontaneously or induced by various physical and chemical agents. The DNA synthesis (replication) is not an error-free process. In Eschrichia coli there is about 1 error per million nucleotide introduced. Such a change (mutation) is completely random and can happen in any region on the genome. However, such a low mutation rate can be substantially increased by various chemical and physical agents. In this study, high L- asparaginase producing mutants of gram-negative bacterium Enterobacter aerogenes were selected through use of the mutagenic agent ethyl methane sulfonate (EMS). This enzyme which is not found in humans is widely used in cancer chemotherapy and is produced from several gram-negative bacteria including E. aerogenes. In this study, optimal EMS concentration for producing mutants was determined and the enzyme levels of these mutants were compared with the wild-type strain. An indicator medium for the selection of high L-asparaginase producing mutants was utilized and among about 100,000 colonies screened 3 showed a distinctly higher enzyme level than the wild- type strain. These 3 mutants were further isolated and used in the rest of study. In general, all three mutants showed considerably higher L-asparaginase activities, ranging from 30 to 65 %, than the wild-type strain. Among the 3 mutants E. aerogenes ansMU-2 was determined to have the highest enzyme level. However, not all mutants produced by EMS mutagenesis had high L-asparaginase levels. Most of the mutants showed lower L-asparaginase levels than the original wild-type strain and thus were not further included in the study. KEY WORDS: Random Mutagenesis; Ethyl methane sulfonate (EMS); L-asparaginase; Chemotherapeutic enzymes m
