L-asparaginaz geninin (ansB) farklı gram negatif bakterilere klonlanması, izolasyonu ve ekspresyonu

Abstract

Kanser kemoterapisinde yaygın olarak kullanılan L-asparaginaz enzimi sadece birkaç gram-negatif bakteri tarafından sentezlenmektedir. Bu enzimin sitotoksik etki mekanizması L-asparagin bakımından oksotrof olan kanser hücrelerini bu amino asitten yoksun bırakmasına dayanır. Kanser hücrelerinin L-asparagin gereksinimi tamamen eksojen kaynaklı olup, bu kaynak kesildiğinde protein sentezi durur ve hücreler apoptosise sürüklenir. Normal hücreler L-asparagin bakımından prototrof olduklarından böyle bir uygulamadan etkilenmezler. Buradaki çalışmada L-asparaginaz sentezi ile bilinen üç tür gram-negatif bakteri ve onların Vitreoscilla hemoglobin geni (vgb) veya L-asparaginaz geni (ansB) klonlanmış rekombinantları kullanılmıştır. Ayrıca, bu çalışmada ansB klonladığımız Enterobacter aerogenes rekombinantı Ea[pB-PGA] olarak adlandırılmış ve tüm konakçı ve rekombinantların çeşitli besinsel ortamlarda L-asparaginaz sentezleri çalışılmıştır. Oksijen ve çeşitli azot ve karbon kaynakları ile ileri derecede regüle olduğu bilinen ansB geninin farklı bakterilerde ve onların rekombinant suşlarında farklı regülasyonu konusunda bu detayda yapılan ilk çalışmadır. Çalışılmış olan çeşitli karbon kaynakları arasında en yüksek L-asparaginaz sentezi E. aerogenes'de glukozla sağlanırken, bu bakterinin rekombinantları gliserol ortamında glukoza göre 3 kata varan fazla L-asparaginaz aktivitesi göstermişlerdir. Escherichia coli ve onun ansB suşunda en yüksek enzim sentezi laktoz içeren ortamda görülürken, Pseudomonas aeruginosa ve onun vgb rekombinantı (PaJC)'nda en yüksek enzim aktivitesi gliserollü ortamda kaydedilmiştir. PaJC suşu bu ortamda konakçı hücreye göre 2 kat fazla enzim aktivitesi göstermiştir. Tüm bakterilerde mannitol en elverişsiz karbon kaynağı olarak belirlenmiştir. Azot kaynakları bakımından genel olarak tüm bakteriler ve rekombinantları için L-asparagin ve Lglutamin içeren ortamlar L-asparaginaz sentezi için en elverişli ortamlar iken, en elverişsiz azot kaynağı olarak amonyum klorür kaydedilmiştir. Endüstriyel atıklar arasında vinas ve melas genel olarak tüm bakterilerde enzim sentezini en iyi destekleyen ortamlar olmuşlardır. Tarafımızdan oluşturulan klonun (Ea[pBPGA]) konakçısına göre bu ortamlarda 3 kat fazla enzim sentezi yaptığı kaydedilmiştir. Benzer şekilde E. coli'nin ansB klonu konakçısına göre melas ortamında yaklaşık 7 kat fazla enzim aktivitesi göstermiştir. P. aeruginosa'da vinas ortamında kaydedilen L-asparaginaz aktivitesi tez kapsamında kullanılan tüm ortamlar içinde ölçülmüş olan en yüksek değer olarak kaydedilmiştir. Bu ortamdaki enzim aktivitesi diğer atıklarda belirlenenin 14 katına varan oranlarda bulunmuştur. Kullanılmış olan zengin besi ortamları arasında tüm bakteriler için en yüksek enzim sentezi Terrific Broth (TB) ortamında olmuştur. E. coli ve onun ansB suşu bu ortamda diğer iki zengin ortama göre 2.5-7 kat fazla enzim aktivitesi göstermiştir. Üç ortamda da (TB, LB ve SOB) Ea[pB-PGA] ve PaJC rekombinantı konakçılarından sırası ile 2-10 ve 2-4 kat fazla L-asparaginaz aktivitesi göstermişlerdir.

L-asparaginase, an enzyme widely used in cancer chemotherapy, is synthesized by several gram-negative bacteria. The cytotoxic effect of this enzyme resides on its clearance of L-asparagine amino acid for which cancer cells are auxotroph. When cancer cells are deprived of L-asparagine amino acid, which is acquired exogenously only, the protein synthesis in these cells is blocked and they are destined for apoptosis. Since normal cells are prototroph for Lasparagine they are not affected form such treatment. In this study three gram-negative bacteria known for L-asparaginase synthesis and their Vitreoscilla hemoglobin gene (vgb) or L-asparaginase gene (ansB) cloned recombinants were used. An ansB carrying Enterobacter aerogenes, constructed in this study, was named Ea[pBPGA] and all bacterial hosts and their recombinants were studied with respect to L-asparaginase synthesis in various nutrient media. Given the tight regulation of ansB by oxygen and it carbon catabolite repression and nitrogen regulation, this is the first study in this detail to show differential regulation of this gene in different bacteria and in their recombinant strains. Among carbon sources studied the highest L-asparaginase synthesis in E. aerogenes was achieved with glucose, while the recombinants of this bacteria had 3-fold higher enzyme synthesis in glycerol containing medium than in glucose. Escherichia coli and its ansB strain showed the highest enzyme synthesis in lactose medium. This was the case in glycerol containing medium for Pseudomonas aeruginosa and its vgb recombinant (PaJC). The PaJC strain showed 2-fold higher enzyme activity than the host strain in this medium. Mannitol was determined to be the poorest carbon source with respect to L-asparaginase synthesis in all bacteria. Regarding the nitrogen sources, L-asparagine and L-glutamine were determined as the most suitable sources, while ammonium chloride was the least appropriate one. Molasses and vinasse were the most suitable industrial wastes supporting L-asparaginase synthesis in all bacteria. The ansB recombinant (Ea[pB-PGA]) constructed in this study had 3- fold higher enzyme levels than the host strain in these media. Similarly, ansB clone of E. coli had 7-fold higher L-asparaginase activity in molasse than that of host strain. L-asparaginase level of P. aerugionosa in vinasse was the highest level determined throughout the study. In this medium the enzyme activity was up to 14-fold higher than in other industrial wastes. The enzyme synthesis for all bacteria was highest in Terrific Broth (TB) compared to other rich media used. E. coli and its ansB strain had 2.5-7-fold higher activity in TB than in other rich media. In all three media used, Ea[pB-PGA] recombinant showed 2-10-fold and PaJC recombinant strain 2-4-fold higher activity than their hosts, E. aerogenes and P. aeruginosa, respectively.