Yeni hidrazon türevlerinin sentezlenmesi, radikal giderme aktivitelerinin ve insan serumundan saflaştırılan paraoksonaz-1 enzimi üzerine in vitro inhibisyon etkilerinin araştırılması

Abstract

Bu çalışmada, dört yeni hidrazon türevi sentezlenmiş ve yapıları X-Işını (XRD), Nükleer Manyetik Rezonans (H-NMR), Fourier Dönüşümlü Infrared Spektrofotometre (FTIR), Ultraviyole-Görünür spektrofotometre (UV-VIS) taramaları ve elementel analiz teknikleri ile aydınlatılmıştır. Tüm yeni sentezlenmiş bileşikler, 2,2-difenil-1-picrylhydrazyl (DPPH) yöntemiyle serbest radikal giderme aktiviteleri için taramaya tabi tutulmuştur. En düşük IC50 değerine (0,185 mg/mL) sahip B-2,4-MBPyH bileşiği, DPPH için en yüksek serbest radikal giderme aktivitesi göstermiştir. Paraoksonaz1 (PON1: EC 3.1.8.1) yüksek yoğunluklu lipoproteinlere (HDL) sıkıca bağlı, yapısında kalsiyum içeren bir metalo enzimdir ve memelilerde düşük yoğunluklu lipoproteinlerin (LDL) oksidasyonuna karşı koruyucu etkisi bulunmaktadır. Bu çalışmada, insan serum paraoksonaz1 (hPON1) enzimi, iki-aşamalı yöntem ile; amonyum sülfat çöktürmesi ve Sepharose-4B-L-tirozin-1-naftilamin hidrofobik etkileşim kromatografisi kullanılarak saflaştırılmıştır. Saflaştırılan enzimin SDS-poliakrilamid jel elektroforezinde, 43 kDa molekül ağırlığında tek bir band göstermiştir. Saflaştırılan enzim 21,22 U/mg spesifik aktiviteye sahiptir. Kullanılan yöntem ile % 17,484 verim ve 561,375 saflaştırma derecesine ulaşılmıştır. Ayrıca, paraokson substrat olarak kullanılarak, saflaştırılmış enzimin Km ve Vmax değerleri sırayla 0,018496 mM ve 114,96 U/mL olarak belirlenmiştir. Bu çalışmada, sentezlenen yeni bileşiklerin saflaştırılmış hPON1 üzerine in vitro inhibisyon etkileri de incelenmiştir. Sonuçlar, tüm hidrazin türevlerinin hPON1 enzim aktivitesini derişime bağlı olarak inhibe ettiğini göstermiştir. Çalışılan hidrazon türevleri arasında, en düşük IC50 değerine (0,0138 mg/mL) sahip B-2,3-MBPyH bileşiğinin hPON1 aktivitesi için en etkin inhibitör olduğu bulunmuştur. Bu çalışma, hPON1 aktivitesinin, çalışılan hidrazon türevlerine karşı oldukça yüksek derecede hassas olduğunu göstermiştir. Anahtar Kelimeler: Schiff Bazı, Hidrazon Türevleri, DPPH, hPON1, İnhibisyon, Hidrofobik Etkileşim Kromatografisi.

In this study, four new hydrazone derivatives were synthesized and their structures have been elucidated by X-Ray Diffraction (XRD), Nuclear Magnetic Resonance (H-NMR), Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR), ultraviolet-visible spectrophotometry (UV-VIS) scanning and elemental analysis techniques. All the newly synthesized compounds were subjected to screening for their free radical scavenging activity by 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) method. Compound B-2,4-MBPyH with the lowest IC50 value of (0.185 mg/mL) showed the highest free radical scavenging activity of DPPH. Paraoxonase-1 (PON1: EC 3.1.8.1) is a calcium-dependent enzyme associated with high-density lipoproteins (HDLs) and has a protective effect against oxidation of low-densitylipoproteins (LDLs) in mammals. In this study, human serum paraoxonase1 (hPON1) was purified using two-step procedures, namely ammonium sulphate precipitation and Sepharose-4B-L-tyrosine-1-naphthylamine hydrophobic interaction chromatography. SDS–polyacrylamide gel electrophoresis of the purified enzyme showed a single band with an apparent MW of 43 kDa. The purified enzyme had a specific activity of 21.22 U/mg. The overall purification fold and yield were found to be % 17.484 and 561.375 respectively. Furthermore, using the paraoxon as a substrate, we determined the Km and Vmax values of the purified enzyme, as 0.018496 mM and 114.955 U/mL, respectively. In this study, in vitro inhibition effect of these synthesized novel compounds on purified hPON1 were also investigated by using paraoxon as a substrate. The results showed that all the hydrazone derivatives inhibited the hPON1 enzyme activity in a concentration-dependent fashion. Among the studied hydrazone derivatives, B-2,3-MBPyH was found to be the most effective inhibitor for hPON1 activity, with the lowest IC50 values of (0.0138 mg/mL). The present study has demonstrated that hPON1 activity is very highly sensitive to studied hydrazone derivatives. Key Words: Schiff Base, Hydrazone Derivatives, DPPH, hPON1, Inhibition, Hydrophobic Interaction Chromatography.