Nitrik oksit (NO) makrofajların sitotoksik etkisinin ortaya çıkmasında rol almaktadır. NO’in yapımını nitrik oksit sentaz (NOS) enzimi katalize etmektedir. Sitozolde bulunan bu enzimin, enzimi kodlayan genler, hücre veya organ lokalizasyonlarındaki farklılıklar ve kalsiyum uyarımına verdikleri yanıta göre iki izoformu tanımlanmıştır: 1. Uyarılabilir NOS (inducible NOS-iNOS), 2. Yapısal NOS (constitutional NOS-cNOS). Makrofajlarda iNOS bulunur. Lipopolisakkarit (LPS) ve interferon gamma (IFN-g) iNOS enzimini uyaran maddeler arasındadır. Patojen ajanların IFN-g ile birlikte makrofajların NO salgılanması üzerine sinerjistik etki yapmalarının yüksek düzeylerde üretildiğinde konakçı hücre ve dokularına karşı da zararlı etkileri olabilen NO’in ortamda patojen bir ajan bulunmadıkça üretilmemesi şeklinde bir çeşit düzenleyici mekanizma oluşturduğu düşünülmektedir. Ancak, fare kökenli makrofaj tiplerinin IFN-g ve LPS’in tek başına veya beraber uygulanması durumundaki NO yanıtları, kullanılan hücre tipleri ve araştırma grupları arasında farklılıklar göstermektedir. Bu çalışmada fare makrofaj kökenli RAW 264.7 hücresi kullanılarak IFN-g, LPS ve IFN-g+LPS kombinasyonunun NO sentezi üzerindeki etkileri ve bu etkilerin NG-nitro-L-arjinin-metil ester (L-NAME) ve polimiksin B ile inhibisyonu araştırıldı. Kültür süpernatanlarında NO düzeyi Griess ayıracı ile nitrit düzeyi ölçülerek belirlendi. Sadece IFN-g ile uyarılan hücrelerde doza bağımlı ve LPS uyarımı ile kıyaslanabilir düzeyde NO yanıtının oluştuğu saptandı. IFN-g+LPS kombinasyonu ile uyarılan hücrelerden, tek başına IFN-gveya LPS ile uyarılanlara göre daha fazla NO salgılanmaktadır. IFN-g veya LPS aracılığı ile NO salgılanması L-NAME ile baskılanmaktadır. LPS’nin biyolojik etkilerini inhibe etmek amacıyla in vitro ortamlarda sıkça kullanılan polimiksin B, LPS ile uyarılan hücrelerdeki NO yanıtını inhibe etmenin yanısıra, IFN-g ile uyarılan hücrelerde NO yanıtını da anlamlı düzeyde (p=0.024) baskılamaktadır.
Nitric oxide (NO) takes part in emergence of cytotoxic effect of macrophages. NO production is catalyzed by nitric oxide synthase (NOS). Two isoforms of this enzyme which is found in cytosol have been identified according to the coding genes, differences in cellular or organ localisation and response to calcium stimulation: 1. Inducible NOS (iNOS), 2. Constitutional NOS (cNOS). Macrophages have iNOS. Lipopolysaccharide (LPS) and interferon gamma (IFN-g) are among iNOS stimulating substances. Synergistic effect of pathogenic agents with IFN-g on NO synthesis in macrophages suggests the presence of a possible regulation system leading to an inhibitory effect when no pathogenic agent exists on production of NO, that can also be harmful to host cells and tissues when produced in excessive amounts. However, there are considerable differences in NO responses of murine macrophages to IFN-g, LPS and IFN-g+LPS combination according to the type of the cells and research groups. In this study, using RAW 264.7 murine macrophage cells, effects of LPS, IFN-g and LPS+IFN-g combination on NO synthesis and inhibition of these effects by NG-nitro-L-arjinin-methyl ester (L-NAME) and polymyxin B were investigated. NO levels in culture supernatants was determined by measuring nitrite levels with Griess reagent. Macrophages stimulated only by IFN-g were found to synthesize considerable amount of NO in a dose dependent manner and comparable with LPS stimulation. Macrophages stimulated by LPS+IFN-g combination secreted more NO than the ones stimulated by LPS or IFN-g alone. NO secretion due to IFN-g or LPS was suppressed by L-NAME. Polymyxin B, which is frequently used in in vitro studies in order to inhibit biological effects of LPS, not only inhibited NO response of macrophages stimulated by LPS but also made a considerable suppression of NO response in macrophages stimulated by IFN-g (p= 0.024).
