ÖZET MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS KLİNİK SUŞLARINDAKI IZONIAZID VE RIFAMPIN DİRENCİNİN MOLEKÜLER KARAKTERİZASYONU M. tuberculosis' in rifampin (RIF) ve izoniazid (INH)'e dirençli olması tüberküloz kontrolü için ciddi bir tehdit oluşturmaktadır. İlaca dirençli tüberkülozun kontrolü, dirençli vakaların hızlı ve uygun tedavisine dayanır. Farklı kaynaklardan elde edilen INH ve RIF dirençli M. tuberculosis klinik suşlannm moleküler özellikleri, yaygın olarak kullanılabilecek hızlı moleküler tam metodlarının geliştirilmesinde yararlı bilgiler sağlayabilir. Bu çalışmada; Malatya bölgesinde toplanan 29 ilaca dirençli klinik izolat arasından INH ve RIF direncine neden olan iki gen, otomatize DNA dizi analizi ve multipleks alele özgül PZR(MAS-PZR) kullanılarak incelendi. îzolatlarm 19'u çoğul ilaçlara dirençli, ikisi yalnızca RIF dirençli ve sekizi yalnızca INH dirençli izolatlardı. RIF direnci karakterizasyonu için, RIF direnci göstergesi olarak bilinen 81 bç'lik bölgeyi de içeren RNA polimerazın (3 alt ünitesini kodlayan gen olan rpoB geninin 250 bç'lik merkezi bölgesinin dizi analizi yapıldı. MAS-PZR, kodon 516, 526 ve 531 'i hedef alıyordu. INH direnci karakterizasyonu katalaz-peroksidaz enzimini kodlayan gen olan katG geninin 435 bç'lik bölgesinin dizi analizi yapıldı. Bu bölge INH direnci ile en sık ilişki gösteren kodon 315'i de içeriyordu ve MAS-PZR'de kodon 315'teki mutasyonlann tespiti için kullanıldı. DNA dizi analizi ile RIF dirençli 21 izolatın 10'unda (%47.6) rpoB geninde kodon 531'de, beşinde (%23.8) kodon 516'da, üçünde (%14.2) kodon 526'da ve yine üçünde (%14.2) kodon 513'te mutasyon tespit edildi. Kodon 516'da mutasyona sahip 36olan beş izolatın üçü aynı zamanda kodon 527'de ve biri de aynı zamanda kodon 572'de mutasyona sahipti. INH'a dirençli 27 izolatın 17'sinde (%62.9) katG kodon 315'te mutasyon gözlendi. Bu 17 mutasyonun 14'ü Ser315Thr ve üçü Ser315Asn değişikliği şeklindeydi. MAS-PZR sonuçlanmn, DNA dizi analizi sonuçlan ile uyumlu sonuç vermesi MAS-PZR'nin özellikle kaynaklan sınırlı olan gelişmekte olan ülkelerde INH ve RIF direncinin hızlı tespitinde DNA dizi analizinin yerine kullanılabileceğini düşündürdü. Anahtar kelimeler: Mycobacterium tuberculosis, ilaç direnci, multipleks alele özgül PZR 37
SUMMARY MOLECULAR CHARACTERIZATION OF ISONAZID AND RIFAMPICIN RESISTANCE OF MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS CLINICAL STRAINS Mycobacterium tuberculosis resistance to rifampicin (RIF) and isoniazid (INH) poses a serious threat to tuberculosis control. Control of drug resistant tuberculosis relies on rapid diagnosis and proper treatment of drug resistant cases. Molecular characterization of INH- and RTF-resistant M. tuberculosis clinical strains of different origins can generate information useful for developing rapid molecular diagnostic methods that are widely applicable. In this study, we investigated two genes implicated in INH and RIF resistance respectively among 29 drug-resistant clinical isolates collected from Eastern Turkey, using automatic DNA sequencing and multiplex allele specific PCR (MAS- PCR). The isolates included 19 multidrug resistant, two RIF mono-resistant, and eight INH mono-resistant isolates. For RIF resistance characterization, we sequenced a 250- bp central region of the RNA polymerase P-subunit gene (rpoB) that covers the 81-bp- core region known to be the marker for RIF resistance. The MAS-PCR assays targeted codons 516, 526, and 531. For INH resistance characterization, we sequenced a 435-bp- region of the catalase-peroxidase-encoding gene (katG), including codon 315, the most prevalent mutation site associated with INH resistance and the MAS-PCR was used for detection of the mutation at codon 315. DNA sequencing detected mutations at codons 531, 516, 526 and 513 in 10 (47,6 %), five (23,8 %), three (14,2 %), and three (14,2 %) of the 21 RIF resistant isolates, respectively. Of the five isolates having mutation at codon 516, three also had mutations at codon 527; one had mutation concurrently at codon 572. Mutation at katG codon 315 was seen in 17 (62.9 %) of the 27 INH resistant 38isolates. Fourteen of the 17 mutations were Ser315Thr, and three were Ser315Asn alterations. Results of MAS-PCR showed well correlation to the results of DNA sequencing, suggesting MAS-PCR can be used for rapid detection of INH and RIF resistance in place of DNA sequencing, especially in resource-limited developing countries. Keywords: Mycobacterium tuberculosis, drug resistance, multiplex allele-specific PCR 39
